妙手医生
慢病毒由VectorBuilder包装,并在80°C下冷冻直至使用。Jurkat T细胞通过以1∶25稀释度与慢病毒一起过夜孵育来转导,并且CAR的表达在3天后通过流式细胞术来验证。2018年至2019年期间,从Biological Specialty Corporation商业获得了来自四名健康供体的人类白细胞。通过使用人CD4 (Miltenyi Biotec,目录号130-045-101)和人CD8 (Miltenyi Biotec,目录号130-045-201)微珠的磁激活细胞分选,富集t细胞以获得%3E95%的CD3纯度。用人T-激活剂CD3/CD28 Dynabeads (Gibco)以1∶1的珠细胞比激活CD4/CD8-富集的T细胞,并在完全T-细胞生长培养基:含有5%人AB血清(适马)、IL7(12.5 ng/mL;MiltenyiBiotec)和IL15 (12.5纳克/毫升;Miltenyi Biotec)。在激活后24和48小时,用慢病毒(1∶25稀释)进行两次t细胞转导。t细胞在50毫升生物反应器管(TubeSpin,TPP)中以1-3×10进行扩增6在设置为5 rpm的管辊(ThermoFisher Scientific)上的细胞/mL。在T细胞活化后的第6至7天,通过流式细胞术评估转导效率。在第10天,将细胞产物冷冻保存在T细胞完全生长培养基和CS10(干细胞)的1∶2混合物中在试管内和在活生物体内实验。
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